Larry Daley (Ben Stiller), el ex guardia del turno noche en el Museo de Historia Natural, ahora es un exitoso empresario. Pero, cuando se entera de que sus amigos del museo fueron enviados al Instituto Smithsoniano, Larry recibe un llamado telefónico desesperado de Jedediah (Owen Wilson), avisando que cuatro de los mayores villanos de la historia han cobrado vida y planean tomar el Smithsoniano, para después dominar el mundo. Larry se une a viejos y nuevos amigos para detener la trama liderada por un personaje del Smithsoniano, el hermano de Ahkmenrah, que quiere usar el poder de una tabla mágica egipcia para liberar a un ejército del inframundo.