Kate Beckinsale er tilbage som vampyrheltinden Selene, i denne længe ventede forsættelse til Underworld. Underworld Evolution fortsætter sagaen om krigen mellem de aristokratiske Death Dealers, og de barbariske Lycans (varulvene). Filmen følger starten på den gamle konflikt mellem de to stammer, mens Selene (Kate Beckinsale), vampyrheltinden og hendes kærlighed Michael (Scott Speedman), en Lycan hybrid, prøver at løse gåden om deres blodbånd. Historien om action, intriger og forbudt kærlighed fører dem til en kamp, der vil ende alle krige, da de udødelige må sande gengældelsen.