Der jugendliche Außenseiter Peter (Andrew Garfield) versucht, das Geheimnis seiner Vergangenheit zu lüften und das Herz seiner Highschool-Liebe Gwen Stacy (Emma Stone) zu erobern. Ein mysteriöser Aktenkoffer seines Vaters, der ihn als Kind verlassen hat, führt Peter zu dessen ehemaligen Partner Dr. Connors. Die Enthüllung des Geheimnisses um seinen Vater besiegelt sein Schicksal, „Spider-Man” zu werden und sich Connors' bösartigem Alter Ego, der Echse, zu stellen.