Di giorno, Sydney Bristow è una studentessa universitaria, di notte è una spia internazionale. Le si prospetta un futuro roseo quando il suo ragazzo, il dottor Daniel Hecht, le propone di sposarla. Ma la felicità di Sydney per il fidanzamento dura poco, perché la sua vita segreta ha enormi ripercussioni sul suo rapporto. Allo stesso tempo, scopre nuove verità sui suoi loschi datori di lavoro. La sua è una vita di pericoli e intrighi.
Sydney e Vaughn cercano di rintracciare Sloane e sua figlia Nadia, la sorellastra di Sydney. Ma anche Lauren e Sark sono a caccia di Sloane e Nadia, per scoprire i segreti di Rambaldi. Nel frattempo, l'ossessione di Vaughn di trovare Lauren sta iniziando a consumarlo. Sydney e Vaughn si prendono una rivincita su un vecchio nemico, e Katya confessa la sua attrazione per Jack.
Dopo aver completato la prima missione con Sydney, la vita di Marshall è in grave pericolo. Nel frattempo, il capo del controspionaggio dell'Alleanza Ariana Kane (Faye Dunaway) considera Jack il principale sospettato della scomparsa della moglie di Sloane, Emily. Vaughn scopre la verità sul coinvolgimento di Jack nell'omicidio dell'agente della CIA Haladki; Sydney confida a Francie i suoi sentimenti per un collega; e Vaughn consegna a Will i risultati del suo test psicologico alla CIA.
A Los Angeles, Sydney riceve una terrificante telefonata sul cellulare da parte di Sark, il quale la informa di tenere Will in ostaggio a Taipei. Lo libererà soltanto se Sydney consegnerà il documento di Rambaldi e l'ampolla. Jack fa un accordo con il signor Sark, e l'Alleanza decide il destino di Emily Sloane. Sydney si trova faccia a faccia con "l'Uomo".
Jack incontra il capo del controspionaggio dell'Alleanza, Ariana Kane (Faye Dunaway), inviata a indagare sulle circostanze della scomparsa di Emily e a scoprire chi stia ricattando Sloane. Nel frattempo, Marshall, estremamente agitato, viene inviato per la prima volta in missione, con Sydney come partner; Vaughn chiede a Will di sottoporsi a un esame psicologico alla CIA; e Francie nutre dei sospetti sul comportamento misterioso di Sydney e Will.