元治元年六月、新選組は倒幕派志士二十余名が結集する池田屋に凄絶な斬り込みをかけた。蛤御門の変の後、幕府に長州征討の勅命が下るも、将軍家茂は上洛の気配を見せず、京の町には再び不穏な空気が流れていた。近藤は力の限り新選組によって治安を守ることを決意する。伊東甲子太郎が篠原泰之進他八名を連れて新選組に入隊したのはこの頃だった。慶応元年、新選組は総勢百五十名に達し、近藤は組織を守る為「局中法度」「軍中法度」など鉄の規則を敷いた。だが、倒幕の体制が整うに連れ、新選組の内部でも伊東派の動きが激しくなり、薩摩藩と連絡を取っていた武田が除名、その後斬られた。これを機に伊東派は分離を表明、篠原も近藤の人間味に魅かれながらも脱退する。続いて伊東派は、近藤を暗殺、一挙に倒幕の兵を挙げんとする計画を打ち出すが、これを密偵から聞いた土方は伊東暗殺を決意した。